Calcein-AM/PI 活细胞/死细胞双染试剂盒

产品介绍 

Calcein-AM/PI Double Staining Kit 可用于区分含有酯酶活性的哺乳动物的死细胞和活细胞。Calcein-AM 是在传统的钙黄绿 素（Calcein）上引入乙酰甲氧基甲酯即（AM）基团修饰而成，疏水性显著增加，能够高效穿透细胞膜进入胞内。Calcein-AM 本身无荧光，进入细胞后可被内源性酯酶水解，生成带强负电荷、难以跨膜透出的极性产物 Calcein，并滞留在细胞内，发出强烈绿色荧光（激发/发射波长 Ex/Em =494 nm/517 nm）。由于死细胞缺乏酯酶活性，无法或极少生成 Calcein，因此仅活细胞呈现强绿色荧光，死细胞则染色极弱或不染色。死细胞的细胞膜选择透过性丧失，碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）可进入胞内并与双链 DNA 特异性结合，产生强烈红色荧光（激发/发射波长 Ex/Em=535 nm/617 nm），从而特异性标记死细胞。将 Calcein- AM 与 PI 联合 使用，可实现活细胞与死细胞的同步双重荧光染色，广泛适用于细胞活性检测及细胞毒性评价。

自备试剂 

PBS 缓冲液（pH7.2~7.4）

保存条件

-20°C 避光可保存 1 年。Calcein-AM Solution (500 μl, 100 μM）；Propidium Iodide(PI)(500 μl，750 μM）；Calcein-AM Solution (100 μM)首次使用时建议适当分装并密封避光保存，防止潮湿环境中发生自发性酯水解。

操作步骤

1.流式细胞仪检测
1.1 工作液的配制：
1.1.1 试剂准备：取出保存的 Calcein-AM/PI Double Staining Kit，室温解冻后，涡旋混匀试剂。
1.1.2 配制 Calcein-AM/PI 染色工作液：室温解冻后，将涡旋混匀的 Calcein-AM Solution 和 PI Solution 按照 1~5×10⁵个细胞/200 μL 配制染色工作液。根据实验用量参考下表配制染色工作液。
注：染色工作液中的 Calcein-AM 易潮解，建议现配现用。 提示：为节约试剂及保证实验的准确性，可先将 Calcein-AM Solution 进行梯度稀释，如用 PBS(1X)将 Calcein-AM Solution(100µM) 稀释 100 倍到 1µM。染色前再使用 PBS(1X)将 1µM 的 Calcein-AM Solution 稀释 100 倍到染色浓度（0.01µM)，即 200μL PBS(1X)中加入 2μL 1µM 的 Calcein-AM Solution。

1.1.3 用于阴性对照与补偿调节的单染管工作液配制参考下表配制：

注：染色工作液中的 Calcein-AM 易潮解，建议现配现用；阴性对照管与单染管的细胞选择阳性药物组细胞。
1.2 染色步骤：
1.2.1 收集细胞，300×g 离心 5 min，弃去上清，加入 1 ml PBS 重悬细胞沉淀，300×g 离心 5 min，去上清，重复清洗 1 次，去上清。
1.2.2 每组 1~5×105 个细胞加入 200 μL 染色工作液重悬，室温避光孵育 5~15 min。
1.2.3 孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，若不能及时检测，建议避光置于 4°C 冰箱，2 小时内进行流式细胞仪检测。
注：流式细胞仪检测时，Calcein 可用 FITC 通道，PI 可用 Percp/Cy5.5 通道或 PE 通道。

2. 荧光显微镜检测
2.1 工作液的配制：
2.1.1 试剂准备：取出保存的 Calcein-AM/PI Double Staining Kit，室温解冻后，涡旋混匀各试剂。
2.1.2 配制 Calcein-AM/PI 染色工作液：解冻后，将涡旋混匀的 Calcein-AM Solution 和 PI Solution 按照 96 孔板每孔 100μL 或 24 孔板每孔 200μL 配制染色工作液。根据实验用量参考下表配制染色工作液。注：染色工作液中的 Calcein-AM 易潮解，建议现配现用。

2.2 染色步骤：
2.2.1 小心吸取贴壁细胞的培养基，每孔加入适量 PBS 洗涤细胞，去除 PBS，重复清洗 1 次，除去 PBS。
2.2.2 按照 96 孔板每孔 100 μL 或 24 孔板每孔 200 μL 的比例加入染色工作液，37°C 孵育 10~30 min。（基础培养基配制染色工作液需延长染色时间至 30~60 min，在反应结束前 10 min 加入 PI Solution。）
2.2.3 孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果（Calcein 为绿色荧光，Ex/Em=494nm/517nm；PI 为红色荧光， Ex/Em=535nm/617nm）。
注：若是悬浮细胞，则收集细胞沉淀后，按照 1~5×10⁵个细胞加入 200μL 染色工作液重悬，室温避光孵育 15~20 min，吸取细胞悬液滴加在载玻片上，轻轻盖上盖玻片即可在显微镜下观察拍照。

注意事项
1· 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断、治疗及其他非科研用途。
2· 操作时请注意安全，严格遵守实验室试剂操作规范。为保障安全与健康，实验过程中请穿着实验服并佩戴一次性手套。
3· 请按产品要求在适宜温度下保存，避免试剂失效。
4· 染色前使用无血清培养基（血清中可能含有酯酶）或 PBS 洗涤细胞；缓冲液中不得含有伯胺、仲胺，此类物质可水解 AM 酯并影 响探针负载。
5· 37℃条件下可缩短染色时间；室温染色可减少荧光探针进入细胞器带来的副反应。
6· Mn²⁺ 会加速荧光淬灭，洗涤缓冲液中应避免含 Mn²⁺ 等金属离子。
7· 探针渗漏：AM 酯类探针可能被细胞表面 P 糖蛋白等多药耐药外排泵排出。
8· 本试剂盒适用于所有具有酯酶活性的动物细胞；植物与细菌具有细胞壁，Calcein-AM 无法进入胞内，因此不适用于植物及细菌样本。
9· 可采用 5%~20% DMSO 处理细胞 2~4 h，或 70%乙醇处理细胞 30 min，制备死细胞阳性质控样本。
10· 离心机升降速过快易造成细胞损失，建议设置升速（Acc）≤3，降速（Dec）≤2。
11· 荧光显微镜检测时，贴壁能力较弱的细胞建议先进行防脱处理，再接种与染色；PI 染色时间不宜超过 30 min，否则易出现假阳性。如需延长 Calcein-AM 染色时间，可在染色结束前 10~30 min 加入 PI 染液，染色完成后 1~2 h 内及时观察并拍照。